La glia corticale nei topi SOD1(G93A) è leggermente influenzata dalla SLA

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 6538 (2023) Citare questo articolo

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Il ruolo della glia nella sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è innegabile. La loro attività correlata alla malattia è stata ampiamente studiata nel midollo spinale, ma solo in parte nel cervello. Presentiamo qui uno studio completo della glia nella corteccia dei topi SOD1(G93A), un modello di SLA ampiamente utilizzato. Utilizzando il sequenziamento dell'RNA a cellula singola (scRNA-seq) e l'immunoistochimica, abbiamo ispezionato astrociti, microglia e oligodendrociti, in quattro stadi della malattia, rispettando il fattore sesso. Riportiamo cambiamenti minimi della glia durante la progressione della malattia e indipendentemente dal sesso. Le analisi di pseudobulk e di singole cellule hanno rivelato sottili alterazioni trascrizionali legate alla malattia allo stadio terminale nella microglia e negli oligodendrociti, che erano supportate dall'immunoistochimica. Pertanto, i nostri dati supportano l’ipotesi che la corteccia del topo SOD1 (G93A) non ricapitola la malattia nei pazienti e raccomandiamo l’uso di un modello diverso per studi futuri sulla patologia corticale della SLA.

La caratteristica degenerazione dei motoneuroni (MN) nella SLA provoca inizialmente un'atrofia muscolare progressiva che porta a difficoltà di movimento, parola e deglutizione e insufficienza respiratoria nella fase finale. In generale, la SLA è considerata una malattia multifattoriale con meccanismi patologici poco conosciuti e con una sopravvivenza mediana compresa tra tre e cinque anni. Al momento non esiste una cura o una prevenzione disponibile, solo un trattamento sintomatico.

Sebbene i MN siano riconosciuti come il tipo cellulare primario affetto dalla patologia, numerosi studi hanno confermato che anche le cellule non neuronali, inclusa la glia, subiscono cambiamenti e partecipano alla progressione della SLA1,2. Le cellule gliali rispondono alla neurodegenerazione o alle lesioni mediante vari meccanismi. La microglia e gli astrociti acquisiscono un cosiddetto stato reattivo caratterizzato da cambiamenti nell'espressione genica e nella morfologia. Attraverso l'attivazione delle vie infiammatorie e antinfiammatorie, proteggono il tessuto da ulteriori danni. Tuttavia, nella fase cronica delle malattie hanno un effetto dannoso e contribuiscono alla progressione della neurodegenerazione. Tradizionalmente, gli astrociti reattivi e la microglia erano divisi rispettivamente nei sottotipi A1 e A2 o M1 e M2. Tuttavia, questa terminologia è attualmente considerata obsoleta, poiché molte diverse sottopopolazioni di glia con firme genetiche specifiche sono state recentemente descritte in diversi modelli di malattia3,4,5. Gli astrociti associati alla malattia (DAA), la microglia associata alla malattia (DAM), la microglia a risposta attivata (ARM) e la microglia a risposta all'interferone (IRM), sono solo alcuni esempi di questi. Gli oligodendrociti, d'altra parte, sono più suscettibili ai cambiamenti patologici. In reazione alla malattia, tendono a degenerare anziché trasformarsi in uno stato reattivo. Tuttavia, il loro ruolo passivo nella progressione della malattia è stato recentemente messo in discussione da studi che descrivono il loro contributo all'immunoprotezione, alla segnalazione dell'interferone e all'elaborazione e presentazione dell'antigene6,7.

Il ruolo degli astrociti, della microglia e degli oligodendrociti e i rispettivi cambiamenti correlati alla patologia sono stati riportati più volte nei pazienti affetti da SLA8,9,10. La maggior parte dei dati disponibili proviene dal midollo spinale, ma alcuni studi hanno riportato anche patologie gliali nella corteccia11. I cambiamenti patologici noti sono stati identificati per lo più nel tessuto post mortem, il che non consente lo studio dei meccanismi della malattia, aumentando la necessità di un modello animale affidabile. Attualmente, il topo SOD1(G93A) rappresenta il modello più utilizzato che assomiglia alla SLA12 familiare. Dal punto di vista fenotipico il modello corrisponde al decorso della malattia e gli studi sul midollo spinale e sul tronco cerebrale hanno riportato cambiamenti cellulari correlati alla SLA precedentemente riscontrati nei pazienti2,8,13,14,15,16. La corteccia, tuttavia, sembra essere oggetto di controversia. Il numero di studi è limitato e i risultati suggeriscono esiti contraddittori. Mentre alcuni mostrano che le cellule gliali corticali e i MN sono influenzati dal fenotipo simile alla SLA17,18,19,20, altri non riportano alcun effetto nell'area corticale nel modello SOD1(G93A)21.

0; female: counts of Xist > 0, nFeature_Y < 2, nCount_Y < 2; nFeature_Y being a number of Y-encoded genes and nCount_Y being a number of transcripts mapping to Y chromosome) were excluded from the dataset (Supp. Fig. 1a). These cells classified as ‘Undefined’ comprised almost 1/3 of the total number of cells and represented low quality cells (Supp. Fig. 1b)./p> 1000, 2000 < nCount_RNA < 10,000, percent.mt < 8; microglia—nFeature_RNA > 700, 1000 < nCount_RNA < 10,000, percent.mt < 5; oligodendrocytes—nFeature_RNA > 1300, 2500 < nCount_RNA < 50,000, percent.mt < 5 (Supp. Fig. 1d). Tissue dissociation may induce the expression of IEGs, the first rapid cellular response to stimuli24,30. A set of the IEGs (e. g. Fos and Jun transcription factors) was projected onto the UMAP using AddModuleScore function to investigate the level of induction of these genes by sample preparation (Supp. Fig. 1c). The SoupX R package (version 1.5.2)31 was applied to remove the contaminating RNA background. The unfiltered and annotated data were supplied as the input. The contamination fraction was estimated by the automated method and was in the range from 1 to 2 % for individual samples. The count values were subsequently corrected for the contamination./p> 1 or < − 1 were considered differentially expressed. Males and females were compared at each time point for each cell type and condition. Control (CTRL) and SOD1 pairs were also tested at each time point and for each cell type (end-stage DEGs in Supp. Tab. 1). The Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)32 was performed using clusterProfiler R package (version 4.0.5)33,34. Reference gene set size was limited to 10–800 genes and the significance threshold was set to padj = 0.05. Only results where more than one gene contributed to the enrichment (core enrichment) were considered relevant./p> 0.25, Supp. Tab. 3). The identity of the subclusters was determined by comparison with available gene signatures of various previously described cellular subtypes using the AddModuleScore function and by manual annotation based on the calculated marker genes. Reference gene expression signatures were taken from Habib et al.5 (Gfap-Low and Gfap-High astrocytes), Sala Frigerio et al.4 (ARM, IRM) and Marques et al.35 (MFOL1/2, MOL2, MOL5/6). The intermediate state of astrocytes was visualized using a gene set containing calculated markers of cluster 2 and markers of transition state published by Habib et al.5. The signature of homeostatic microglia resulted from the combination of homeostatic markers mentioned in Keren-Shaul et al.3, Mathys et al.36 and Butovsky and Weiner37. The top 30 genes were used for the projection in astrocytes, and 20 genes were used in the microglia and oligodendrocytes. Numbers of cells entering differential expression analysis (DEA) and subpopulation analysis are provided in Supp. Tab. 4./p>

1 and padj < 0.05. The X chromosome gene Xist was significantly upregulated in the females in all three cell types, regardless of genotype. The Xist gene plays a major role in the gene dosage compensation in females by silencing one of the X chromosomes, and is therefore expressed only in female cells40. Two genes encoded by chromosome Y (Eif2s3y, Uty) were upregulated in males, but the difference in their expression only exceeded the log2FC threshold in astrocytes (Fig. 3b). Apart from these, no other dysregulated genes related to the pathology progression and sex were found in our data./p> 1, padj < 0.05), confirming the validity of the SOD1(G93A) model. Other dysregulated genes were mostly noncoding or ribosomal transcripts that evaded quality control. Additionally, the 4 M CTRL samples were marked by an increased expression of genes Cdk8 and Cmss1 across all cell types. These two genes were identified in the subsequent analysis as confounders negatively effecting sub-clustering results (Supp. Fig. 2a, b). Therefore, they were considered as biasing factors without connection to the ALS-like pathology. Together, these results show minimal variation in gene expression related to the pathology progression in the cortex of the SOD1(G93A) mouse, regardless of sex, with the indication of subtle changes in microglia and oligodendrocytes in the late phase of the disease./p>

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